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          雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (高通量)說明書

           更新時間:2023-04-06 點擊量:870

          雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (高通量)說明書

          上海起發(fā)生物科技有限公司(Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.)屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司(2009年成立)旗下的子公司,成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌,打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時,把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè),共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè),圓夢中國。

          產(chǎn)品詳情

          貨號

          規(guī)格

          價格

          78EA10008-100T

          100T

          1,440.00

          產(chǎn)品描述

          報告基因檢測常用于研究真核生物基因表達調(diào)控,螢火蟲螢光素酶 和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發(fā)出生物螢光(bioluminescence),這種發(fā)光反應具有良好的光學特征和濃度線性范圍,同時檢測的靈敏度高,可達到 10-20mol。兩種催化反應最適濃度不同,因此互不干擾, 配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng),其中海腎螢光素酶常作為內(nèi)參照。

          螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kDa 的蛋白,在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin,在此過程中會發(fā)出波長約為 560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為 36 kDa 的蛋白,在氧氣存在的條件下,催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide,在此過程中會發(fā)出波長約為 480 nm 的生物螢光。在后加入海腎螢光素酶底物時,可有效淬滅螢火蟲熒光素酶催化 luciferin 的發(fā)光,而不干擾海腎螢光素酶的活性,從而實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。生物螢光可以通過化學發(fā)光儀(luminometer))或多功能酶標儀進行測定。通過螢光素酶與其底物催化發(fā)光的體系,可以高效、靈敏地檢測基因的表達。檢測原理如圖所示:

           

           image.png

           1.熒光素酶報告基因反應原理圖

           

          產(chǎn)品組成

          試劑盒組分:

          名稱

          規(guī)格

          保存條件

          5x Universal lysis BufferULB

          20 mL

          -20℃

          Fluc Buffer A

          5 mL

          -20℃

          Fluc substrate

          干粉

          -20℃

          Rluc Buffer B

          干粉 5 mL

          -20℃

          50x Rluc substrate

          100 μL

          -20℃

          運輸與保存

          冰袋運輸,-20℃保存 個月,-80℃保存更長時間。

          實驗步驟

          1. 試劑準備:

          11x Universal lysis BufferULB)配置:取所需體積的 5x Universal lysis Buffer 臨用前用三蒸水稀釋至1x;

          2)Fluc buffer A 工作液:試劑盒開始啟用時,將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中,適當吹打搖勻至粉末充分溶解后,分裝到棕色管中-20℃保存?zhèn)溆茫?/span>

          3)Rluc Buffer B 工作液:臨用前取 50x Rluc substrate  Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用(按需配置),配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內(nèi)使用有效(試劑配置過程中注意避光)。

          2. 細胞裂解:

          1) 細胞裂解:取出孔板放置至恢復室溫,加入適量體積 1x ULB 振蕩器搖勻,室溫裂解 15min。細胞裂解液推薦使用量:

           

          細胞培養(yǎng)板型號

          96 孔板

          24 孔板

          12 孔板

          孔板

          1x Universal lysis BufferULB/

          30 μL

          60 μL

          80 μL

          120 μL

           

          2) 熒光酶標儀設定,正確開啟儀器,點擊檢測,選擇生物發(fā)光檢測功能,根據(jù)本批樣本的靈敏度選擇合適增益與積分時間,默認為增益 135,積分時間 10 s。

          3. 檢測:

          1)移液槍吹打混勻裂解液后,吸取 20 μL 到黑色孔板底部。樣品數(shù)量過多時候建議使用移液槍經(jīng)轉(zhuǎn)移和后續(xù)加液操作,若使用四周不透光的培養(yǎng)板可省略轉(zhuǎn)移操作

          2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A,輕柔快速吹打混勻三次后,室溫孵育反應 5-10min 后,上機檢測記錄發(fā)光值(F 

            3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B,輕柔快速吹打混勻三次后,室溫孵育反應 5-10min 后,上機檢測記錄發(fā)光值(。

          為保證結(jié)果準確性,在加入 Fluc buffer A Rluc buffer B 后,請在 1h 內(nèi)完成檢測

           

          實驗案例分析

           96 孔板中接種適量細胞過夜至貼壁狀態(tài),第二天進行如下轉(zhuǎn)染:1.含有FXR 基因啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因表達載體質(zhì)粒;2.含有 FXR 基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子 E2 功能的重組表達載體質(zhì)粒;3.海參熒光素酶重組表達載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染 6h 向每孔中加入不同單體藥物培養(yǎng) 48h,其中設置空白溶劑 DMSO 組。最后按試劑盒說明書操作裂解隨后進行熒光素酶報告基因活性檢測,結(jié)果如下(對應孔中所標白色字體數(shù)值為陽性激動劑的激動倍數(shù)

          image.png

           3 . 59 種單體藥物對基因啟動子區(qū)熒光素酶報告基因激動倍數(shù)熱圖(A1:為空白溶劑對照組;A2-J6: 59

           FDA 上市藥物的實驗組)

          經(jīng)過上述實驗的高通量篩選確定 F3 孔對應單體藥物對FXR 啟動子區(qū)激動效果強,激動倍數(shù)為 45。同某進口P"品牌一同測定該藥物對FXR 基因的激動曲線,并計算 EC50,結(jié)果如下:

           image.png

           4.紅色:起發(fā)生物品牌測定 F3 單體藥物激動 FXR 基因啟動子區(qū)熒光素酶報告基因響應曲線;黃色:進P"品牌測定F3 單體藥物激動 FXR 基因啟動子區(qū)熒光素酶報告基因響應曲線(EC50

          1. 數(shù)據(jù)分析:

          1)實驗設計:根據(jù)實驗目的,每組實驗均應設置空白對照組,對照組和處理組。

          a. 空白對照組

          背景 F:未轉(zhuǎn)染細胞裂解液+ Fluc buffer A。

          背景 R:未轉(zhuǎn)染細胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

          注:空白對照組樣品量須與實驗樣品量相同,且與實驗樣品含有相同的培養(yǎng)基/血清組合。

          b. 對照組:轉(zhuǎn)染細胞未經(jīng)實驗因素處理 (即對照組 F 和對照組 R)。

          c. 實驗組:轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)實驗化合物處理 (即實驗組F 和實驗組 R)。

          計算結(jié)果:對照組比值=(對照組 F-背景 F)/(對照組 R-背景 R),實驗組比值=(實驗組 F-背景 F/(實驗組 R-背景 R)。

           

          表達倍數(shù)實驗組比值/對照組比值。

          注意事項

          1) 反應溫度:酶促反應對溫度較為敏感,加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養(yǎng)液平衡至室溫20-25。

          2) 檢測儀器:能檢測化學發(fā)光的儀器都適用,但由于不同儀器的設置和靈敏度不同,測得的光信號值也會不同。 檢測板:為防止孔間干擾,推薦使用不透光酶標板。

          3) 發(fā)光信號會受到檢測環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響,應確保同組內(nèi)不同樣本檢測條件一致。

          4) 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套。

          5) 本產(chǎn)品僅作科研用途!


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